Info Teknologi » Aplikasi PCR dalam Pengelolaan Plasma Nutfah dan Pemuliaan Tanaman di Era Molekuler

dsc_5282 pcr2
Identifikasi molekuler plasma nutfah akabi dengan metode PCR memperkecil/menghilangkan duplikasi nomor aksesi

Reaksi berantai polimerase/Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan metode memperbanyak (amplifikasi) fragmen DNA spesifik menggunakan penanda molekuler dengan bantuan enzim polimerase. PCR merupakan reaksi dasar yang telah berkembang dan banyak dimanfaatkan dalam pemuliaan tanaman.

Pemuliaan tanaman secara konvensional membutuhkan waktu untuk memastikan karakter target terwariskan dan terekspresi pada keturunan hasil persilangan (progeni). Jumlah populasi dalam tahap seleksi khususnya seleksi awal umumnya cukup besar sehingga membutuhkan tenaga, waktu, dan biaya yang tidak sedikit. Metode PCR dinilai efektif dan efisien untuk: (1) identifikasi galur tetua yang tepat untuk perbaikan karakter khusus sehingga mengurangi jumlah persilangan; (2) konfirmasi pewarisan alel yang sesuai pada tiap generasi hasil persilangan; dan (3) identifikasi individu sasaran diantara turunan yang bersegregasi sesuai karakter yang diinginkan sehingga seleksi menjadi lebih terarah.

Komponen utama dalam reaksi PCR adalah: (1) DNA template yang akan diamplifikasi; (2) Primer; (3) DNA polimerase yaitu, enzim yang mengkatalisis reaksi sintesis DNA; dan (4) dNTP (deoksiribonukleotida trifosfat) yang terdiri atas dATP, dTTP, dGTP, dan dCTP. DNA polymerase dan dNTP umumnya telah tersedia dalam satu paket larutan yang sering disebut kit PCR. Primer merupakan fragmen oligonukleotida pendek, terdiri atas 18-25 basa nukleotida yang mengawali sintesis fragmen DNA target. Urutan basa penyusun primer komplementer dengan fragmen DNA target.

Reaksi PCR terdiri atas beberapa tahap yaitu, denaturasi, annealing, elongasi dan post elongasi (Gambar 1). Reaksi pertama adalah denaturasi yang bertujuan melepaskan ikatan hidrogen sehingga rantai ganda DNA terlepas. Suhu yang biasa digunakan adalah 950 C selama 5 menit. Masing-masing rantai tunggal DNA yang terbentuk akan menjadi cetakan untuk membentuk DNA berikutnya.

Setelah rantai ganda DNA terpisah, suhu diturunkan, agar primer dapat melekat pada rantai tunggal DNA yang terbentuk saat denaturasi dan mulai mengamplifikasi DNA. Proses ini biasanya berlangsung selama 1-2 menit dan disebut annealing. Suhu yang digunakan pada proses annealing menentukan keberhasilan pelekatan primer dengan fragmen DNA target. Penentuan suhu annealing dilakukan sebelum PCR melalui proses yang disebut optimasi kondisi PCR.

Proses selanjutnya adalah elongasi yaitu, proses pembentukan rantai DNA yang baru oleh enzim polimerase. Suhu dinaikkan kembali menjadi 720 C, selama kurang lebih 2 menit. Selanjutnya, suhu dinaikkan menjadi 950 C agar ikatan hidrogen antara rantai DNA yang terbentuk dengan primer dapat terlepas dan proses berulang ke tahap annealing. Siklus PCR berlangsung kurang lebih 20-40 kali. Produk dari setiap akhir siklus akan menjadi substrat atau cetakan bagi siklus berikutnya.

Gambar 1. Reaksi berantai polimerase (Jakubowski 2010)

Gambar 1. Reaksi berantai polimerase (Jakubowski 2010)

Prosedur Analisis PCR

  1. Menyiapkan larutan stok yang terdiri atas: Kit PCR, free water atau aquabidest (tergantung protokol pada kit yang digunakan), dan primer. Volume dan konsentrasi akhir yang diperlukan untuk setiap komponen biasanya telah tercantum pada protokol kit PCR. Contoh pembuatan larutan stok tercantum pada Tabel 1.
    No. Komponen Volume Per Sampel Jumlah sampel

    (tube)

    Volume Stok Konsentrasi akhir
    1 Kit PCR 5 µl 10 50 µl
    2 Forward primer 0,5 µl 10 5 µl 10 µM
    3 Reverse primer 0,5 µl 10 5 µl 10 µM
    4 DNA Template 1 µl 10 ng
    5 Aquabidest 3 µl 10 30 µl
    Volume Total 10 µl 90 µl
  2. Menambahkan DNA template. DNA template ditambahkan ke dalam mikrosentrifuge tube 0,2 ml. Proses pembuatan larutan stok, pembagian stok ke dalam mikrosentrifuge tube 0,2 ml, dan penambahan DNA template dilakukan dalam keadaan dingin mennggunakan ice box yang telah berisi es batu.
  3. Spin down. Tube yang telah berisi komponen PCR disentrifugasi agar larutan tercampur rata. Kecepatan sentrifugasi 3000 rpm selama 1 menit cukup untuk proses spin down dan membuat larutan menjadi homogen
  4. Setting kondisi dan proses PCR. Semua tube dimasukkan ke dalam mesin PCR, kemudian di-setting pada kondisi yang diinginkan. Contoh kondisi PCR tercantum pada Tabel 2.

Keberhasilan PCR ditentukan oleh beberapa faktor yaitu: (1) jenis DNA polimerase; (2) primer; (3) deoksiribonukleotida trifosfat (dNTPs); (4) fragmen DNA cetakan; dan (5) komposisi larutan buffer (Sambrook & Russell 2001). Selain itu, faktor teknis dan non teknis seperti suhu annealing juga berpengaruh terhadap keberhasilan proses PCR.

Tahap annealing merupakan titik krusial dalam proses PCR. Suhu annealing sangat menentukan penempelan primer yang akan mengawali amplifikasi. Jika suhu tidak tepat, primer dapat gagal menempel pada fragmen DNA target atau menempel pada fragmen DNA non target. Setiap primer membutuhkan suhu annealing yang spesifik dan tidak berbeda jauh dari titik leleh primer (TM). Konsentrasi primer dan DNA juga berpengaruh terhadap keberhasilan PCR. Suhu annealing dan konsentrasi DNA yang bervariasi antar peneliti dan perbedaan spesies objek dengan tema penelitian yang sama menjadi landasan melakukan optimasi.

Aplikasi metode PCR dengan Simple sequence repeat (SSR)

Beberapa contoh aplikasi metode PCR adalah pemanfaatan mikrosatelit atau Simple Sequence Repeat (SSR) dalam proses seleksi (Lestari et al. 2017), analisis keragaman genetik kedelai (Nugroho et al. 2017) dan pengembangan identitas spesifik untuk plasma nutfah varietas lokal kedelai (Lestari et al. 2016).

  1. Seleksi. Proses seleksi galur menggunakan penanda molekuler dan metode PCR sering disebut Marker Assisted Selection (MAS). Lestari et al. (2017) melaporkan pemanfaatan SSR pada tahap seleksi yaitu konfirmasi pewarisan alel dari tetua ke progeni persilangan generasi F1 tanaman kedelai. Pewarisan alel tetua tujuh kombinasi persilangan kedelai pada progeni generasi F1 dikonfirmasi dengan sembilan penanda SSR. Hasil PCR divisualisasikan pada gel elektroforesis sehingga terlihat pita-pita DNA. Gambar 2 merupakan visualisasi hasil PCR tetua tujuh kombinasi persilangan dan progeni generasi F1 dengan salah satu penanda SSR yaitu, Satt191.
    Pita DNA yang terlihat menggambarkan suatu alel. Posisi pita yang sejajar menandakan kesamaan alel. Keberhasilan persilangan ditunjukkan dengan keberadaan alel dari kedua tetua pada progeni F1. Sedangkan, alel yang sama dengan hanya salah satu tetua menunjukkan bahwa progeni tersebut merupakan hasil silang mandiri (selfing) tetua persilangan. Contoh interpretasi Gambar 2 adalah sebagai berikut: a dan b pada gambar atas adalah tetua persilangan dari c hingga l. Satu dari sepuluh progeni F1 yaitu j memiliki alel yang sama dengan kedua tetua, sedangkan sembilan lainnya memiliki alel yang sama hanya dengan salah satu tetua yaitu tetua a. Progeni c – i dan k-l merupakan hasil selfing tetua a, sedangkan j merupakan hasil persilangan.
  2. Analisis keragaman genetik. Analisis keragaman genetik dengan SSR sama dengan analisis keragaman genetik menggunakan karakter kuantitatif dan kualitatif. Pola pita DNA yang muncul diberi skor sehingga terbentuk data biner. Data hasil skoring bersama karakter lain dianalisis kekerabatan untuk menghasilkan dendogram. Nilai kesamaan genetik hasil analisis kekerabatan menjadi pertimbangan dalam memilih tetua persilangan. Kombinasi persilangan sebaiknya dibentuk dari dua tetua dengan nilai kesamaan genetik rendah untuk memperbesar peluang terbentuknya keragaman genetik.
  3. Pengembangan nomor identitas spesifik (ID) dalam pengelolaan plasma nutfah. Daerah/lokasi berbeda dapat memberikan nama yang berbeda pada individu tanaman dengan karakter morfologi yang sama. Proses identifikasi secara molekuler diperlukan untuk memastikan individu tersebut adalah varietas yang jelas sama atau berbeda. Identifikasi molekuler diyakini lebih tepat dibandingkan identifikasi berdasarkan karakter morfologi yang sering dipengaruhi oleh faktor lingkungan.

Penanda SSR yang terpilih berdasarkan nilai polymorphism information content (PIC), indeks keragaman genetik, jumlah alel spesifik, dan estimasi jarak genetik, digunakan dalam amplifikasi DNA individu-individu tanaman yang ingin diidentifikasi.

Kode kuantitatif merupakan transformasi ukuran alel terpaut masing-masing penanda pada tiap varietas. Kode ID tiap varietas tersusun dari urutan kode kuantitatif. Sebagai contoh, penelitian Lestari et al. (2016) menggunakan enam penanda SSR dalam identifikasi 29 varietas kedelai lokal di Indonesia. Kode kuantitatif untuk setiap kisaran ukuran alel hasil amplifikasi DNA oleh masing-masing penanda tercantum pada Tabel 3.

Tabel 3. Pemberian kode kuantitatif (koding) untuk setiap kisaran ukuran alel hasil amplifikasi DNA oleh enam penanda SSR sebagai kandidat set penanda dan satu identifier untuk identifikasi varietas lokal kedelai
pcr3
Sumber: Lestari et al. (2016)

Varietas Singgalang (II) memiliki ukuran alel 180, 178, 105, 154, 133, dan 116 bp secara berurutan untuk lokus Satt009, Satt038, Satt177, Satt242, Satt308, dan Satt114. Berdasarkan Tabel 3, ukuran alel pada varietas Singgalang (II) ditransformasikan menjadi kode 00, 01, 00, 04, 00, 04 untuk tiap lokus SSR dari set penanda. Kode kuantitatif tersebut dirangkai menjadi ID varietas Singgalang (II) yaitu 000100040004. Prosedur yang sama diterapkan untuk seluruh varietas.

Implikasi Pengelolaan Plasma Nutfah di Balitkabi

Koleksi plasma nutfah Balitkabi terdiri atas varietas unggul, galur-galur hasil persilangan atau materi penelitian, dan varietas lokal. Banyaknya koleksi berpotensi mengakibatkan duplikasi penomoran pada koleksi yang sesungguhnya identik secara genetik. Pengembangan nomor identitas berdasarkan identifikasi molekuler menggunakan metode PCR dapat diterapkan dalam pengelolaan koleksi plasma nutfah Balitkabi sehingga tidak terjadi duplikasi nomor.

 

Pratanti Haksiwi Putri